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薄膜人生

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日志

 
 

紫外可见分光光度法测定蛋白质含量  

2008-06-03 13:14:12|  分类: 镀膜技术 |  标签: |举报 |字号 订阅

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一、实验目的

   1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

   2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

   3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。 

二、实验原理

    1.(1)紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

       (2)紫外光:10-400 nm,可见光:400-780 nm,可被人们的眼睛所感觉

       (3)紫外-可见吸收光谱的特点:带光谱、分子光谱。

       (4)应用:根据最大吸收波长可做定性分析;根据朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法)可做定量分析。

           a.定性分析原理:

                吸收曲线:吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状

           b.定量分析原理:

            根据朗伯-比耳定律:A=εbc,当入射光波长λ及光程b一定时,在一定浓度范围内,有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

            定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标的标准曲线,测出试液的吸光度,就可以由标准曲线查得对应的浓度值,即未知样的含量。

         2. 本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

   (1)蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,服从朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

   (2)由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所处的微环境也不同,所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计,浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间,平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。

三、仪器与试剂

    TU-1901紫外-可见分光光度计,比色管(10ml的5个),吸量管、标准蛋白质溶液:5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液,待测蛋白质溶液(牛血清白蛋白) 

四、实验步骤

   1.基本操作

    (1)启动计算机,打开主机电源开关,启动工作站并初始化仪器,预热半小时。

    (2)用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg./mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中,用0.9% NaCl溶液稀释至刻度,摇匀。用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液为参比.

    (3)在工作界面上选择测量项目为光谱扫描,设置扫描参数(起点:400nm,终点:250nm,速度:中,间隔:1.0nm,单次扫描)

    (4)将两个均装有0.9%NaCl溶液的1 cm石英比色皿放入测量池中,进行基线扫描。

   2.吸收曲线的绘制:

     将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液,点击START进行扫描,得到如下吸收曲线,从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278 nm,此波长下的吸光度为0.2114。 

3.标准曲线的制作:

     在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件(测量波长:279.00 nm)。

用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液为参比,在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278,记录所得读数。

4.样品测定

取2ml的待测蛋白质溶液,用%0.9的NaCl溶液稀释至10ml,按上述方法测定278nm处的吸光度的值。平行测定三次。

五、数据记录及处理

1.吸收曲线的绘制

2.标准曲线的绘制及样品标注

序号

编号

类型

浓度 [mg/ml]

Abs

1

标准样品1

标准样品

0.4

0.261

2

标准样品2

标准样品

0.5

0.321

3

标准样品3

标准样品

0.6

0.376

4

标准样品4

标准样品

0.7

0.439

5

标准样品5

标准样品

0.8

0.509

 

序号

编号

类型

浓度 [mg/ml]

Abs

1

未知样品1

未知样品

0.601

0.382

2

未知样品2

未知样品

0.627

0.398

3

未知样品3

未知样品

0.632

0.401

平均

 

 

0.6192

0.393

 

根据上述做图,将吸光度值代入直线表达式可以计算出c=0.4063mg/ml,则原蛋白质溶液中蛋白质含量为c0:

c0*2=0.4063*10,则c0=2.032mg/ml

 

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